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Einzelzellableitungen

Die Einzelzellableitung ist ein Teilgebiet der Elektrophysiologie, welches elektrische Aktivität im Körper (bzw. in diesem Fall im Gehirn) misst. Gemessen werden exzitatorische und inhibitorische Signale, sowie allgemein Aktionspotentiale am Soma.

Die räumliche Auflösung bewegt sich zwischen 1cm (→ EEG) und 1μm (→ Einzelmessung).

Geschichte - Ableitung der el. Aktivität

Luigi Galvani vs. Alessandro Volta

Luigi Galvani (1737–1798) und Alessandro Volta (1745–1827) konnten Muskelkontraktionen in Froschschenkeln auslösen. Uneinig waren sie sich jedoch in welcher Form diese Kontraktion funktioniert. Während Volta sich die Kontraktion analog zu einem Kondensator vorstellte, war Galvani der Überzeugung es würde wie eine Art Detektor funktionieren.

Beginn der Elektrophysiologie

Karl August Weinhold

Karl August Weinhold (1782–1829) konnte in einem Versuch eine Katze zu einer Bewegung bringen. Während das zentrale Nervensystem nicht aktiv war, erreichte er die Bewegung allein über elektrische Reizung. Außerdem konnte er das Herz wieder zum Schlagen bringen.

Emil Heinrich Du Bois-Reymond

Emil Heinrich Du Bois-Reymond (1818–1896) entdeckte das Aktionspotential, aufgrund zu träger Messinstrumente gelang ihm der Nachweis zunächst nur indirekt. Er etablierte außerdem die Elektrophysiologie als Wissenschaft und bereitete die Grundlage des Elektrokardiogramm, des Elektroenzephalogramm und des Elektromyogramm.

Andrew Fielding Huxley, John Carew Eccles, Alan Lloyd Hodgkin

Die drei Wissenschaftler Huxley (*1917), Eccles (1903-1997) und Hodgkin (1914-1998) zeichneten sich durch die Entwicklung der Ionentheorie der Erregung aus (→ Nobelpreis 1963). Sie fanden heraus, dass die abgreifbaren Potentiale an der Membran durch eine Ionenverschiebung zustande kommen.

Elektrophysiologie

Definition

Die Elektrophysiologie ist ein Teilgebiet der Physiologie, das sich mit dem Ionenfluß in biologischem Gewebe und den entsprechenden elektrischen Techniken zur Messung befasst.

Sinnhaftigkeit

Die Ableitung von elektrischen Informationen aus Zellen ist sinnvoll, da nur mit dieser Methode Aussagen über individuelle Funktionscharakteristika der Zelle getroffen werden können.

Methode

Dünne Elektroden werden in den extrazellulären Bereich gebracht, in dem sie elektrische Veränderungen messen. Dabei werden jedoch die Potentialverschiebungen mehrerer angrenzender Zellen gemessen. Über bestimmte Verfahren kann auch auf eine Zelle zurückgerechnet werden. Das Messen im intrazellulären Bereich ist zwar deutlich genauer und „einfacher“, die Zelle kann dabei jedoch beschädigt werden.

Die Methode der Elektrophysiologie ist invasiv. Ein oder mehrere Elektroden werden üblicherweise in folgende Gewebe eingeführt:

  • Lebendes Gewebe
  • Entnommenes Gewebe (akut oder als Kultur)
  • Einzelne Zellen entnommenen Gewebes

Zellphysiologie

Größenverhältnis

Eine Zelle hat einen Durchmesser von ungefähr 50μm bis 100μm, ein Axon von gerade nur 1μm bis 3μm.
Zum Vergleich: Ein Haar hat einen Durchmesser von 50μm bis 80μm.

Zelltypen [Exkurs]

  • Purnkinje Zelle → Kleinhirnrinde, Größte Neurone im Kleinhirn, Großer Zellkörper & weit verzweigter Dendritenbaum
  • Pyramidenzelle → Nur Großhirnrinde, Große Nervenzellen, Name von Gestalt ihres Soma
  • Mitralzelle → Zweites Neuron der Riechbahn aus dem Bulbus olfactorius
  • Motoneuron → Nervenzelle des ZNS, Direkte oder indirekte Kontrolle über Muskel, Efferente Nervenbahnen

Membran

Die doppelschichtige Zellmembran besteht aus Fett-Molekülen (Lipide). Die Membran trennt intrazellulären und extrazellulären Raum. Durch die Membran können nur bedingt Stoffe gelangen. Für einen kontrollierten Stoffaustausch befinden sich in der Membran entsprechende aktive Ionenkanäle (Pumpen) und passive Ionenkanäle.

Grundsätzlich gibt es mehr passive tex:K^+-Kanäle als passive tex:Na^+-Kanäle.

Ionenverhältnis

Ionenverhältnis

Innerhalb und außerhalb der Zelle befinden sich unterschiedliche Ionenkonzentrationen. Wegen einem Konzentrationsgefälle (→ Konzentrationsgradient) entsteht ein osmotischer Druck.

  • tex:K^+-Ionen diffundieren nach außen
  • tex:Na^+-Ionen diffundieren nach innen

Die Konzentrationen setzen sich wie folgt zusammen:

Außerhalb
  • Wenige tex:K^+-Ionen (→ tex:4 {mmol \over l})
  • Viele tex:Na^+-Ionen (→ tex:150 {mmol \over l})
  • Viele tex:Cl^--Ionen (→ tex:120 {mmol \over l})
Innerhalb
  • Viele tex:K^+-Ionen (→ tex:150 {mmol \over l})
  • Wenige tex:Na^+-Ionen (→ tex:12 {mmol \over l})
  • Wenige tex:Cl^--Ionen (→ tex:4 {mmol \over l})

Na/K-Pumpe

Da die passiven tex:K^+-Kanäle in der Überzahl sind, gelangen mehr positive Kationen (K+) in den extrazellulären Bereich. Der intrazelluläre Bereich wird negativer.

Dagegen steuert die tex:Na^+/K^+-Pumpe, welche Adenosintriphosphat (ATP) in Adenosindiphosphat (ADP) trennt, wobei Energie frei wird. Mit Hilfe dieser Energie werden 3 tex:Na^+-Ionen aus der Zelle herausgepumpt und 2 tex:K^+-Ionen in die Zelle hinein. Die Pumpe wirkt der Diffusion bzw. dem osmotischen Druck entgegen.

Ruhepotential

Da durch die tex:Na^+/K^+-Pumpe insgesamt mehr positive Ladungen nach außen, als nach innen transportiert werden ergibt sich eine negative Spannung (Bezugspunkt außen), welche im Normalzustand dauerhaft gehalten wird (→ Ruhepotential).

⇒ Das Ruhepotential liegt bei ca. -70mV bis -90mV.

Messung (Nachweis)

Das Ruhepotential kann mittels einer sehr dünnen Glaspipette (< 1μm) gemessen werden. Die Glaspipette ist dafür mit einer leitenden Salzlösung gefüllt.

Aktionspotential

Aktionspotential

Zu einer Zeit kann eine Nervenzelle Informationen von bis zu 1000 anderer Nervenzellen integrieren und sendet bei Aktivierung Informationen an 5000 – 10.000 weitere Zellen aus!“ (Braitenberg & Schütz, 1991)

Aktionspotentiale werden durch eine Ionenverschiebung ausgelöst und funktionieren nach dem „Alles-oder-Nicht“-Prinzip. Die Spannung an der Membran ändert sich bis zu einer Amplitude von +30mV und wird unabhängig vom einkommenden Signal immer auf dieses Niveau gebracht. Die Amplitude zeigt nicht die Intensität des Potentials!

Depolarisation

Die Depolarisation des Aktionspotentials wird ausgelöst, sobald ein gewisser Schwellenwert in der Schwankung der Ionen erreicht ist.

Sobald ein elektrisches Signal am Axonhügel ankommt, verändert sich die Ionenkonzentration durch spannungsgesteuerte Ionenkanäle, welche sich durch ein ankommendes Signal öffnen. Unter einem bestimmten Schwellwert (ca. -55mV) wird die Spannung wieder abgebaut und es passiert nichts. Ab der Überschreitung eines bestimmten Schwellwertes (ca. -55mV) wird die Depolarisation ausgelöst, in der unaufhaltsam ein starker Spannungsanstieg statt findet (bis ca. +30mV), da sich bei Überschreitung des Schwellwertes die Öffnung der Ionenkanäle explosionsartig fortsetzt. Bei der Überschreitung des Schwellwertes können sowohl zeitliche Summation als auch räumliche Summation eine Rolle spielen.

  • Zeitliche Summation → Mehrere Potentiale kommen direkt hintereinander am Axonhügel an und addieren sich auf.
  • Räumliche Summation → Mehrere Potentiale kommen von verschiedenen Stellen relativ Gleichzeitig an und addieren sich ebenfalls auf.

Bei der Summation spielen sowohl erregende Potentiale (EPSP → Exhibitorisches postsynaptisches Potential), als auch hemmende Potentiale (IPSP → Inhibitorische postsynaptisches Potential) eine Rolle. Es kann also am Axonhügel auch zu einer „Subtraktion“ kommen.

⇒ Nach der Depolarisation folgt die Repolarisation (Abbau des Potentials), mit einem kleinen „Überschuss“, der Hyperpolarisation, die in den Bereich von ca. -90mV reicht.

Refraktärphase

Während dem Ablauf eines Aktionspotentials (→ Depolarisation und Repolarisation) ist keine weitere Potentialverschiebung, also kein weiteres Aktionspotential möglich. Dieser Zeitraum wird als Refraktärphase bezeichnet. Die Refraktärphase ist die Grundlage für dir Fortleitung des Aktionspotentials. Da nach hinten keine Aktivierung möglich ist (da Refraktärphase), kann sich das Aktionspotential nur nach vorne ausbreiten.

Absolute Refraktärphase

Die absolute Refraktärphase beginnt 1ms bis 2ms nach Beginn des Aktionspotentials. In dieser Phase sind die Ionenkanäle so „beschäftigt“, dass weitere elektrische Potentiale zu keiner Aktivierung führen.

Relative Refraktärphase

In der relativen Refraktärphase ist eine erneute Aktivierung möglich, sie ist jedoch erschwert, da in dieser Phase die Hyperpolarisation stattfindet, welche negativer ist, als das Ruhepotential. Das einkommende Signal muss also um ca. 20mV höher sein als normal um den Schwellwert zu erreichen.

Methoden der Elektrophysiologie

Mikroelektroden

Es gibt eine Vielzahl verschiedener Elektroden:

  • Glaspipetten-Elektrode
  • Metallmikroelektrode (Wolfram, Stahl, Platin)
  • Kohlefaserelektrode (Keine toxische Wirkung bei Langzeitableitung)
  • Mehrkanalelektrode (Bündel verschiedener Kapillare, Transmitterinjektion möglich)
  • Büschelelektroden (Bündel mehrerer Kapillare für mehrere Neurone)

Prinzipielle Formen der Ableitung

in vitro

Das in vitro (lat. „im Glas“) Verfahren wird an Gewebeschnitten (häufig Hippocampus) oder an vereinzelten Zellen (z.B. Riesenaxon von Tintenfischen) angewendet.

in vivo

Das in vivo (lat. „im Lebendigen“) Verfahren wird an lebendigen Tieren (z.B. Implantate), an anästhetisierten Tieren oder auch beim Mensch (z.B. Tumor, Epilepsie) angewendet.

ex vivo

Das ex vivo (lat. „außerhalb des Lebendigen“) Verfahren werden Zellen, Gewebe oder Organe entnommen. Diese werden über einen begrenzten Zeitraum kultiviert und untersucht (nur Amphibien, z.B. Schildkröten).

Ableitungsverfahren

Intrazelluläre Ableitung

Die Intrazelluläre Ableitung wird im Normalfall mit einer Mikropipette durchgeführt. Um eine Spannung zu erhalten müssen sowohl das Potential des intrazellulären, als auch das Potential des extrazellulären Bereiches gemessen werden. Aus Stabilitätsgründen ist diese Art der Messung kaum am wachen Lebewesen möglich.

Extrazelluläre Ableitung

Bei der extrazellulären Ableitung wird nur der äußere Bereich der Zelle gemessen. Dabei sollte die Pipette nur maximal 50μm Abstand von der Zelle haben, da sonst weitere Aktionspotential-Schwankungen mit aufgezeichnet werden. Um unterschwellige Potentiale auszuschließen werden die aufgenommenen Signale hochpass-gefiltert (d.h. nur die hohen Potentiale werden aufgezeichnet).

Patch Clamp

Die Patch Clamp Methode wurde von Erwin Neher und Bert Sakmann beschrieben (Nobelpreis 1991). Die Mikropipette wird dabei auf die Membran der Zelle aufgesetzt und mit einem leichten Unterdruck fixiert. Dabei wird sie so positioniert, dass sie exakt über einem Ionenkanal liegt. Nun kann das Verhalten der Zelle über diesen Ionenkanal beobachtet werden. Es kann festgestellt werden wann der Kanal offen und wann geschlossen ist.

High density microelectrode array

Bei dieser Methode werden mehrere Zellen gleichzeitig gemessen. Auf einer Silikonscheibe sind 100 Mikroelektroden „schachbrettartig“ in einem Abstand von 400μm angebracht. Angewendet wurde dieser „High density microelectrode array“ z.B. als Implantat im Motorkortex von Rhesusaffen.

Messauswertung

Local Field Potential / Multi Unit Activity

Bei einer Messung erhält man neben den Aktionspotentialen, die man messen möchte (→ Spikes), auch einige Zusatzinformationen von benachbarten Zellen (→ Rauschen). Üblicherweise wird bei ca. 300Hz bis 400Hz das Signal gefiltert. Alle darüber liegenden Signale bilden die Multi Unit Activity (MUA), welche den Aktionspotentialen entsprechen. Alle darunter liegenden Signale bilden das Local Field Potential (LFP), welches dem Rauschen, also der Summe der EPSPs und IPSPs entspricht.

Single Unit Activity

Bei Multi Unit Activity sind die Aktionspotentiale (→ Spikes) mehrerer Zellen enthalten. Das Ziel ist jetzt an dieser Stelle die Aktionspotentiale den einzelnen Zellen zuzuordnen und auf die Single Unit Activity zu schließen.

Nach einer Verstärkung und Filterung sind die einzelnen Spikes, die sich in der Nähe der Pipette befinden (50μm bis 100μm) bereits gut zu erkennen. Die Spikes können an dieser Stelle den entsprechenden Neuronen zugeordnet werden.

Spike-Sorting

Tetroden

Tedroden sind Elektroden mit mehreren electrode tips, welche sehr nah aneinander liegen. Da an jedem tip ein etwas anderes Signal ankommt, lassen sich die Spikes leichter aussortieren und entsprechenden Zellen zuordnen (→ spike-sorting).

Darstellung

Dargestellt werden können die Spikes entweder in einem Peri-Stimulus-Zeit-Histogramm (PSTH), bei dem die Stimuli einfach in Häufigkeit pro Zeit abgebildet werden. Eine andere Möglichkeit ist ein Punkt Histogramm, bei dem die Häufigkeit pro Raum (?) abgebildet ist.

Weitere Verfahren und Messmethoden

Rezeptives Feld

Definition

Als rezeptives Feld wird der Bereich z.B. im Blickfeld bezeichnet, in welchem ein Stimulus präsentiert werden muss, damit er an einer bestimmten Stelle gemessen werden kann.

Messaufbau

Zunächst muss garantiert sein, dass sich der Stimulus im rezeptiven Feld befindet. Anschließend werden verschiedene Messpunkt festgelegt, welche bei Aktivierung des rezeptiven Feldes aktiv sind.

Bei der Messung werden die Messpunkt nun simultan abgeleitet. Der Stimulus kann nun verändert werden (Form, Geschwindigkeit, Nähe, etc.) und dabei können die Änderungen der abgeleiteten Signale aufgezeichnet, gefiltert und anschließend ausgewertet werden.

Stereotaxie

Als Stereotaxie (stereotaktische Methode) wird ein operativer Eingriff in das Gehirn bezeichnet, bei dem die zu operierende Stelle nicht freigelegt wird. Der Eingriffsort wird geometrisch berechnet. Der Kopf des Probanden wird dabei fixiert, damit eine exakte Operation möglich ist. Heutzutage wird dabei auch oft Computertomographie, Magnetresonanztomographie, sowie computergestützte Instrumentenführung eingesetzt. Die Operation kann durch diese Maßnahmen nahezu verletzungsfrei verlaufen.

Ethik

Vorgaben

Bezüglich Tierversuchen gibt es relativ strenge Vorgaben:

  • Verwendung der sinnesphysiologisch niedrigst entwickelte Tierart, die gerade noch die für den Versuch ausreichend ist
  • Prüfung und Genehmigung jeder Studie im Voraus
  • Reglementierung durch staatliche und wissenschaftliche Institutionen
  • Korrekte Haltung und Pflege (auch im Eigeninteresse der Wissenschaftler)

Rhesusaffen

Rhesusaffen sind für die Psychologie beliebte Versuchstiere, da sie ein differenziertes Sozialverhalten und eine Menge kognitiver Leistungen erbringen. Zusätzlich besteht inzwischen ein umfassendes Wissen über Aufbau und Funktion des Gehirns.

Vorteile / Nachteile

Vorteile

  • Genaue Lokalisierung von Hirnarealen
  • Aufklärung der an Prozessen beteiligten Neurone
    • z.B. sensorischer und motorischer Kortex (Homunculus)
    • z.B. Aufbau des Cortex
  • Wichtige Grundlage für weitere Verfahren
    • z.B. EEG, MEG, MRT, fMRT, CT, TMS, etc.

Nachteile

  • Wenige Informationen über die dynamik des neuronalen Netzwerkes
  • Geringe Zellenanzahl im Vergleich zu ca. 20 Milliarden existierenden
  • Invasiv und daher am Mensch kaum möglich
  • Sehr aufwändig, vor allem in komplexen Organismen
  • Teilweise schwierig replizierbar und zu verallgemeinern
 
uni-leipzig/psychologie/module/methoden2neuro/4.txt · Zuletzt geändert: 2011/08/01 18:49 (Externe Bearbeitung)
 
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